• одышкой при минимальной физической нагрузке, при прогрессировании заболевания - даже в покое;
• сухим кашлем, реже с выделением скудной мокроты;
• затруднением дыхания;
• резким похудением, общей слабостью и пр.
КТ-изображение “сотового” легкого: у пациента диагностирован идиопатический легочный фиброз
По происхождению выделяют:
• идиопатический легочный фиброз (причина не установлена);
• вторичный:
• вызванный факторами внешней среды (курение, работа на вредном производстве, острое отравление);
• связанный с перенесенными заболеваниями (пневмонией, туберкулезом и пр.)
Для диагностики применяют визуализирующие методы исследования, главным из которых является компьютерная томография.
Видно ли пневмофиброз на КТ легких
Компьютерная томография является золотым стандартом в диагностике пневмофиброза. Данное исследование позволяет с высокой вероятностью выявить рубцовые изменения, определить точное положение, размеры, форму и прочие характеристики. КТ основано на применение рентгеновского излучения для создания черно-белых изображений изучаемой области, на которых участки различной плотности отражены изменением интенсивности затенения.
При появлении беспокоящих признаков следует обратиться к врачу. Специалист выдаст направление на исследование. Пройти процедуру можно в клинике “Магнит”, расположенной около станции метро “Технологический институт”.
Пневмофиброз легких на КТ: представленные на снимке изменения выявлены после проведения лучевой терапии
Перед диагностикой проводится беседа, в ходе которой выявляют противопоказания:
• беременность;
• вес, превышающий 150 кг.
Для более четкой визуализации изменений проводят КТ с введением контрастного препарата. Вещество распространяется по кровотоку, на снимках меняется интенсивность изображения некоторых структур. Данная процедура не проводится:
• при наличии аллергии на йод;
• гиперфункции щитовидной железы;
• лечении метформином;
• высоком показателе креатинина крови;
• лактации.
КТ признаки пневмофиброзных изменений в легких
Компьютерная томография позволяет увидеть мельчайшие рубцы, которые обычно образуются на месте очага воспаления после заживления. Подобные образования могут появляться в зоне оперативных вмешательств.
На определенной стадии развития фиброза визуализируют изменения по типу “матового стекла” в месте повышения плотности легочной ткани. Очаги выглядят более светлыми по сравнению со здоровыми участками паренхимы, так как хуже пропускают рентгеновские лучи.
При массивном распространении фиброза характерна картина “сотового легкого”. Данное название получили многочисленные кистозные полости, расположенные в несколько рядов. Внутри содержится воздух. Стенки таких образований толще, чем нормальные межальвеолярные перегородки. При гистологическом исследовании выявлено, что данные элементы представлены соединительной тканью. Наблюдается усиление развития периферического интерстиция.
Нормальное строение легочных ацинусов нарушено. Пораженные участки ткани выключаются из газообмена, так как не способны выполнять свои функции.
Изменения могут наблюдаться в пределах одного легкого или распространяться на обе стороны. Если фиброз локализован в пределах единичного сегмента дыхательной паренхимы, патологию называют очаговой. При распространении соединительной ткани в разных долях обоих легких диагностируют диффузный процесс. Чем больше процент поражения, тем серьезнее клиническая картина и хуже прогноз.
Очаги изменения легочной ткани по типу “матового стекла”
КТ или МРТ при пневмофиброзе легких
Магнитно-резонансная и компьютерная томография являются информативными методами диагностики. Исследования позволяют получить срезы изучаемой области и создать трехмерную модель. Выбор процедуры осуществляют индивидуально для каждого клинического случая. Учитывают какие именно структуры нужно исследовать, предполагаемый диагноз, имеющиеся у пациента противопоказания.
МРТ основано на фиксации движения атомов водорода в искусственно создаваемом магнитном поле. Данным способом хорошо исследовать ткани, содержащие много воды. При визуализации полых или подвижных органов изображение получается нечетким и мало информативным. Легкие не рекомендуют исследовать с помощью магнитно-резонансной томографии. Сканирование может служить дополнительным методом или применяться при наличии противопоказаний к проведению КТ.
Компьютерная томография является методом выбора в диагностике легочных патологий. Фиброз хорошо виден на КТ-снимках. Исследование выполняется быстро и не требует длительной подготовки. При сканировании с контрастированием нужно заранее выполнить анализ крови на креатинин для определения функционирования почек. Данный лабораторный тест можно пройти в клинике “Магнит” непосредственно перед исследованием. Для сдачи крови необходимо не принимать пищу минимум 4 часа до анализа.
Положение пациента на столе томографа при проведении КТ легких
Изобретение относится к коллагена I типа>0,039 нг/мл. Общий коллаген определяли медицине, а именно пульмонологии, а также фармацевтической промышленности и биотехнологии, и предназначено для получения средства, обладающего антифибротической активностью, которое может быть использовано для профилактики
гидроксипролина>1,95 нг/мл, для гиалуроновой кислоты>15,6 пг/мл и для и лечения пневмофиброза.Среди средств для антифиброзной терапии могут использоваться лекарственные средства на основе гиалуронидазы, поскольку этот фермент препятствует образованию коллагеновых волокон и является наиболее универсальным средством воздействия на соединительную ткань. Однако препараты на основе нативной гиалуронидазы малоэффективны. При парентеральном пути введения они быстро инактивируются ингибиторами сыворотки крови. Кроме этого эти препараты термолабильны, требуют длительного курса лечения, и при их применении возможно развитие аллергических реакций у пациента [Самцов А.В., Лучина Е.Н. Клинический опыт применения препаратов на основе гиалуронидазы: комплексная терапия Рубцовых
деформаций кожи. Экспериментальная и клиническая дерматокосметология, 2012, №6, С. 33-37].Гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза (далее - ГЭБНА) - фермент из семейства гиалуронидаз. Специфическая активность нативной ГЭБНА заключается в расщеплении гиалуроновой кислоты на низкомолекулярные фрагменты. Известно, что ГЭБНА препятствует гибели клеток альвеолярного эпителия и развитию пневмофиброза у мышей, однако ее концентрация в тканях легкого из-за воздействия протеолитических ферментов быстро уменьшается, что приводит к прогрессии фиброза легких. Задача защиты фермента от действия ингибиторов сыворотками крови решается путем его связывания
с высокомолекулярными инертными носителями.Технический результат, достигаемый данным изобретением, заключается в создании средства для профилактики и лечения пневмофиброза и разработке способа получения этого средства, при котором исключено
ионизирующее воздействие на сам фермент.Заявленный технический результат достигается в средстве для профилактики и лечения пневмофиброза, полученном путем облучения раствора триблок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена ионизирующим излучением и последующим добавлением к облученному раствору гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы и стабилизатора и представляющем прозрачный раствор, обладающий специфической активностью гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы от 50 до 150 УЕ/мл, с величиной pH от 4,5 до 7,5, мутнеющий при термостатироваиии выше 30°C и вновь становящийся прозрачным при охлаждении до температуры от 15 до 25°C. Заявленный технический результат достигается также в способе получения заявляемого средства, включающем облучение раствора триблок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена с концентрацией от 0,25 до 8,00% ионизирующим излучением (потоком ускоренных электронов или гамма-излучением) в дозе от 0,25 до 2,00 Мрад и последующее добавление к облученному раствору гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы до концентрации от 50 до 200 УЕ/мл, и растворимого в воде неорганического стабилизатора. В качестве растворителя используют очищенную воду или водные буферные растворы, обеспечивающие поддержание pH от 4,5 до 7,5. В качестве триблок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена используют полимер с нижней критической температурой растворения от 30 до 40°C (например, Pluronic L31 производства фирмы BASF, Германия), в качестве гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы используют нативную бычью тестикулярную гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазу (например, производства ООО «Самсон-Мед», Санкт-Петербург, Россия), а в качестве стабилизатора - хлористый натрий в концентрации 0,9%. В качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов, полученный любым доступным способом, например в промышленном импульсном линейном ускорителе ИЛУ-10. В целях хранения к полученному раствору заявляемого средства может быть добавлен консервант (предпочтительно вещество, не проявляющее поверхностно-активные свойства и не содержащее атомы тяжелых металлов, например бензоат натрия) до концентрации в растворе не более 0,1%, после чего раствор подвергают стерилизующей фильтрации и производят розлив и фасовку в стерильную упаковку в
стерильных условиях, например во флаконы. Заявляемое средство используют в виде раствора.Отличие заявляемого средства от прототипа заключается в том, что по сравнению
с прототипом заявляемое средство:- эффективно при применении не только в терапевтическом, но и в профилактическом режиме: на модели частично обратимого пневмофиброза мышей при профилактическом режиме введения статистически достоверно снижает уровень коллагена 1 типа, гидроксипролина, гиалуроновой кислоты и
общего коллагена до уровня интактного контроля;
Кроме того, заявляемое средство получено способом, при котором:- исключено облучение ГЭБНА ионизирующим излучением, что способствует сохранению активности фермента, уменьшению технологических потерь
и снижению себестоимости продукта;- в качестве высокомолекулярного полимера-носителя используют блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена, который в силу своих физико-химических свойств позволяет флаконы в стерильных в легких и проходить через эпителий
дыхательных путей и альвеол;заявляемому средству кумулироваться условиях.Прозрачность и цветность раствора определялась визуально, pH - иотенциометрически, специфическая активность - прямой гидролитической реакцией полученного средства с гиалуроновой кислотой.
In vivo специфическое действие заявляемого средства было изучено на мышиных моделях частично обратимого и необратимого пневмофиброза.1. Модель частично обратимого пневмофиброза мышейИнтраназальное введение заявляемого средства в профилактическом режиме препятствует отложению коллагена в ткани легких у мышей. При окрашивании легкого по Ван-Гизону в легких больных животных, получавших препарат в профилактическом режиме, наблюдается уменьшение площади отложения фиброзных масс по сравнению с
контролем. Эффективность заявляемого средства при профилактическом режиме введения выше эффективности иммобилизированной на полиоксиэтилене и нативная ГЭБНА субплевральное рубцевание аналогичное человеческому заболеванию, поэтому модель токсического пневмофиброза, вызванная интратрахеальным введением блеомицина, наиболее широко применяется в экспериментах по изучению патогенеза и поиску возможных способов лечения фиброзных заболеваний легких. Однако в условиях однократной интратрахеальной инсталляции блеомицина вызываемый пневмофиброз частично обратим, в связи с чем на экспериментальных животных, получавших блеомицин однократно, невозможно изучение аспекта медленного и необратимого прогрессирования заболевания. Необратимый пневмофиброз (в том числе идиопатический пневмофиброз) развивается в силу многократно повторяющихся (циклических) травм альвеолярного эпителия. В основе животной модели циклического повреждения легкого выступает многократное интратрахеальное введение блеомицина с помощью интубации трахеи. Гистологические показатели легких при многократном введении блеомицина более коррелирует с человеческим идиопатическим пневмофиброзом, чем однократная инсталляция цитостатика. В связи с вышеизложенным при изучении антифибротического действия заявляемого конечной формы продукта влияет на уровень коллагена 1 типа, гиалуроновой кислоты и
общего коллагена, а нативная ГЭБНА не изменяет эти
показатели.Результаты морфологических исследований и ИФА показывают, что при частично обратимом фиброзе заявляемое средство препятствует токсическому разрушению альвеолярного эпителия и развитию пневмофиброза. Эффективность заявляемого средства значительно превосходит активность иммобилизированной на полиоксиэтилене и нативной ГЭБНА.2. Модель необратимого пневмофиброза мышей
При изучении специфической активности заявляемого средства на модели необратимого пневмофиброза у мышей показано, что интраназальное введение заявляемого средства в терапевтическом режиме препятствует
повреждению легких, при этом отмечается значительное уменьшение содержания соединительной ткани в паренхиме легких (табл. 3). В этих условиях иммобилизированная на полиоксиэтилене паренхиме легких и фибротических масс в паренхиме легких (ежедневно с 10-х по 20-е сутки после введения блеомицина).
2. Модель необратимого пневмофиброза
Для моделирования необратимого пневмофиброза в первые сутки эксперимента раствор блеомицина вводят мышам интратрахеально из расчета 80 мкг блеомицина в 30 мкл физиологического раствора на мышь, далее - в 7, 14, 21, 28-е сутки эксперимента раствор блеомицина вводят интраназально из расчета 80 мкг блеомицина в 15 мкл физиологического раствора на мышь. Контрольным животным в аналогичных условиях вводят эквивалентный объем физиологического раствора (группа контроля). Для сравнения используют интактных животных (группа интактного контроля).
Специфические эффекты заявляемого средства исследовали в сравнении с иммобилизированной на полиоксиэтилене ГЭБНА (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент", г. Новосибирск) и нативной тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой (ООО Самсон-Мед, г. Санкт-Петербург, Россия). Препараты вводили интраназально в терапевтическом режиме - в качестве стабилизатора используют хлористый натрий, разрешенный к применению
в фармацевтических средствах, в концентрации 0,9%, что соответствует концентрации в физиологическом растворе и обеспечивает минимальное раздражающее воздействие на эпителий дыхательных путей.Заявляемое средство позволяет увеличивать время действия ГЭБНА без потери эффективности за счет
связывания с инертным носителем, защищающим ее от денатурирующего воздействия протеаз и ингибиторов и обеспечивающим сохранение фармакологической активности без повышения дозы и частоты введения. Антифибротическое действие заявляемого средства показано на модели блеомицин-индуцированного частично обратимого и необратимого пневмофиброза мышей при введении
в профилактическом и терапевтическом режимах.Блеомицин относится к группе цитостатиков. Основное токсическое действие блеомицин оказывает на легкие: вызывает пневмонию, фибротические изменения в в фазу отложения с помощью стандартной кривой Sircol™ анализа (Biocolor Ltd, UK) в соответствии с инструкциями изготовителя, предел обнаружения: 1,0 мкг/100 мкл.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. 2% водный раствор Pluronic L31 облучают потоком ускоренных электронов в дозе 0,5 Мрад на импульсном линейному ускорителе ИЛУ 10. В облученный раствор вносят хлористый натрий до концентрации 0,9% и нативную бычью тестикулярную ГЭБНА до концентрации 100 УЕ/мл, перемешивают при комнатной температуре, добиваясь полного растворения, и получают готовое средство, представляющее собой прозрачный раствор слабокоричневого цвета без осадка и посторонних включений, с pH от 4,5 до 7,5, обладающий специфической активностью ГЭБНА 100 УЕ/мл, становящийся мутным при термостатировании выше 30°C и вновь становящийся прозрачным при охлаждении до температуры от 15 до 25°C. Готовое средство подвергают стерилизующей фильтрации и производят розлив и фасовку в стерильные средства было использовано 2 модели экспериментального
пневмофиброза.1. Модель частично обратимого пневмофиброзаЧастично обратимый пневмофиброз
моделируют однократным интратрахеальным введением раствора блеомицина мышам из расчета 80 мкг блеомицина сульфата (Blenoxane®; « Paulo», Бразилия) в 30 мкл физиологического раствора на
одно животное. Контрольным животным в аналогичных условиях вводят
эквивалентный объем физиологического раствора (группа контроля). Для сравнения используют интактных животных (группа интактного контроля).Специфические эффекты заявляемого средства исследовали в сравнении с иммобилизированной на полиоксиэтилене ГЭБНА (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент", г. Новосибирск) и нативной тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой (ООО Самсон-Мед, г. Санкт-Петербург, Россия). Препараты вводили интраназально, ежедневная доза препаратов составляла 8 УЕ.Препараты испытывали в двух режимах - профилактическом и терапевтическом. Профилактический режим: введение препаратов проводят в фазу становления воспалительной реакции (ежедневно с 1-х по 5-е сутки после введения блеомицина). Терапевтический режим: введение препаратов проводят животным заявляемого средства в профилактическом режиме площадь коллагеновых волокон уменьшается до уровня интактного контроля, а при введении в терапевтическом режиме - уменьшается в 2,25 раза (p=0,0037). Антифибротическая активность заявляемого средства также значительно превосходит активность иммобилизированной на полиоксиэтилене и нативной ГЭБНА.
Уровни коллагена I типа, гидроксипролина, гиалуроновой кислоты и общего коллагена определялись в гомогенатах легких методом ИФА на 21 сутки эксперимента, когда наблюдается наибольшее уменьшение количества фибротических масс в легких под влиянием заявляемого средства. Результаты представлены в таблице 2: выявлено снижение под влиянием заявляемого средства уровней коллагена I типа на 36,6%, гидроксипролина на 36,3%, гиалуроновой кислоты на 34,2% и общего коллагена (на 41,1%) по сравнению с контролем (таблица 2), при этом иммобилизированная на полиоксиэтилене ГЭБНА снижает только уровень гидроксипролина и не (на 10-20-е сутки эксперимента), ежедневная доза препаратов составляла 8 УЕ.Исследования легких проводили на 3, 7, 14, 21-е сутки опыта на модели частично
обратимого пневмофиброза и на 21, 40, 60-е сутки опыта на модели необратимого пневмофиброза. Эвтаназию мышей осуществляли передозировкой CO, после чего изучали морфологическую картину легких.Для проведения гистологических исследований стандартно обработанные легкие мышей окрашивали
по Ван-Гизону на соединительную ткань. С помощью компьютерного
графического анализа на стандартной площади гистологического среза измеряли площадь коллагеновых волокон в ткани легкого. Затем вычисляли долю этих показателей от стандартной площади среза.Уровни коллагена I типа, гидроксипролина и гиалуроновой кислоты определялись методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями производителя (Cusabio Biotech CO., Ltd, China). Чувствительность ИФА для ГЭБНА. Таблица 1 показывает, что при введении оказывают более слабое влияние на количество фибротических масс в паренхиме легких. К 60-м суткам эксперимента погибают 30% животных из контрольной группы, а также получавших иммобилизированную на полиоксиэтилене и нативную ГЭБНА. При лечении заявляемым средством все животные выживают.
Таким образом, заявляемое средство эффективно в условиях необратимого пневмофиброза при терапевтическом режиме. Антифибротическая активность препарата превосходит иммобилизированную на полиоксиэтилене и нативную ГЭБНА. Это позволяет оценивать заявляемое средство как новый и перспективный инструмент для лечения пневмофиброза.
Пример 2. Заявляемое средство получали так же, как в примере 1, при этом концентрация водного раствора Pluronic L31 составляла 4%.